RESUMEN

Los estudios medioambientales precisan de nuevas herramientas analíticas que permitan establecer y diagnosticar las posibles consecuencias sobre los seres vivos, lo sistemas de producción, recursos agrícolas y pesqueros, y en definitiva su influencia sobre el hombre y los entornos urbanos. El estudio de la presencia de los contaminantes debe ir unido a sus respuestas biológicas. Estos estudios son especialmente importantes cuando se consideran disruptores endocrinos (compuestos organometálicos, detergentes, PAHs, PCBs) por su acción crítica sobre los sistemas acuáticos como consecuencia de no disponerse de depuradoras eficiente para estos contaminantes. La puesta a punto de metodologías analíticas adecuadas y eficientes para estos contaminantes debe ir unido al desarrollo tecnologías ómicas, las cuales pueden jugar un papel esencial para un mayor conocimiento de las respuestas biológicas. Esta propuesta se centra en marismas y ecosistemas acuáticos de la región transfronteriza de España y Portugal. Se considera en particular la Bahía de Cádiz, la Ría de Huelva, el Paraje Natural Marimas del Odiel (Huelva), en las que habitan numerosas aves migratorias y una rica población de invertebrados , el Estero Domingo Rubio, las Marismas de Isla Cristina, el Río Guadiamar (en la frontera España Portugal) y la Ría Formosa (Portugal). Como bioindicadores se emplearan Scrobicularia plana, Chamalaea gallina y Nerea diversicolor, aunque el estudio no excluye el estudio de algunas especies ictícola o marisqueras de interés comecial o alimentaria.

Se utilizarán metodologías analíticas de última generación como los acoplamientos HPLC-MS, HPLC-ICP-MS, procedimientos proteómicos basados en 2-DE con MALDI-TOF-MS, y tecnicas metalómicas con cromatografía multidimensional, ICP-MS, y espectrometría de masas en tandem.

FINALIDAD DEL PROYECTO

Antecedentes

El suroeste de la península ibérica, especialmente en la zona fronteriza entre España y Portugal existen diversos entornos acuáticos, estuarios y marismas cuya situación medioambiental depende críticamente de los aportes de sustancias contaminantes como consecuencia de la actividad agrícola e industrial, así como de la influencia de los vertidos urbanos y acuicolas. Un gran número de los contaminantes conocidos son tratados y eliminados de las aguas residuales mediante una red normalizada de depuradoras, pero en fechas recientes se ha detectado la presencia de nuevos contaminantes (contaminantes emergentes) cuya naturaleza química limita la acción de los sistemas de depuración. Entre ellos se encuentran los disruptores endocrinos (DE) cuya acción toxicológica escapa, además, al proceso normal de evaluación del riesgo ambiental. Una característica importante de los EDs es que estas sustancias pueden ejercer su acción incluso en concentraciones enormemente bajas. Algunos de estos disruptores del sistema endocrino son de origen natural mientras que otros muchos son antropogénicos, y pueden afectar a todo tipo de organismos vivos.

Zona de Estudio

El estudio se centrará en diversos ecosistemas del sistema costero del suroeste de España-Portugal (región Algarve-Huelva), donde se localizan varias marismas de gran importancia ecológica: Ría Formosa (Portugal), Río Guadiana (España-Portugal), Marismas de Isla Cristina (Huelva), Paraje Natural Marismas del Odiel (Huelva) en las que habitan numerosas aves migratorias y una rica población de invertebrados (Scrobicularia plana, Nereis diversicolor, Chamelaea gallina).

Finalidad

Se pretende desarrollar procedimientos analíticos para el estudio, la caracterización y diagnosis de la presencia de fármacos de carácter genérico en muestras de marismas con importancia ecológica de la frontera sur de España-Portugal, en la zona Algarve-Huelva.

OBJETIVOS DEL PROYECTO

Objetivo General

1. - Desarrollar procedimientos analíticos para el estudio, la caracterización y diagnosis de la presencia de fármacos de carácter genérico en muestras de marismas con importancia ecológica de la frontera sur de España-Portugal, en la zona Algarve-Huelva

Objetivo Específico

1. Poner a punto metodologías analíticas para el análisis de disruptores endocrinos en los ecosistemas en estudio
2. Aplicar metodologías analíticas en ecosistemas del suroeste de España-Portugal (región Algarve-Huelva).
3. Estudiar biomarcadores moleculares basados en la caracterización de enzimas antioxidativas, enzimas biotransformadoras, daños oxidativos en biomoléculas, y niveles de metalotioneinas y acetilcolinoesterasa.
4. Estudiar los efectos causados por fármacos en diversos bioindicadores de la zona de estudio: (i) S. plana (hepatopancreas y branquias) y Nereis diversicolor.
5. Integrar los resultados y análisis de datos.

METODOLOGÍA Y PLAN DE TRABAJO

Se realizaría un muestreo de sedimento y organismos en estaciones seleccionadas en cada una de las zonas de estudio a fin de:

1. Analizar los niveles de los compuestos Ibuprofeno, Diclofenac y Carbamezapine en diversas estaciones.
2. Realizar ensayos sobre el efecto de los farmacéuticos en peces, moluscos y copépodos, analizando respuestas a nivel de estrés oxidativo, proteómico y genómico.

A. Puesta a punto de metodología para análisis de disruptores endocrinos.

Contaminantes metálicos y especies químicas

 

• Análisis de metales totales
  La determinación de metales se hará en las muestras de suelos/lodos y biota (Scrobicularia plana y Chamelaea gallina y Nereis diversicolor). Las muestras liofilizadas de los bioindicadores se someterán a ataque por microondas y análisis con ICP-MS, con la celda de colisión cuando sea necesario.
• Especiación de mercurio
  Las muestras se analizarán utilizando un procedimiento que el grupo de la UHU ha desarrollado. Esta metodología se basa en el uso de HPLC acoplado a ICP-MS mediante un dispositivo para la generación de vapor frío (HPLC-CV-ICP-MS), realizando la extracción asistida con baño de ultrasonidos para las muestras de tejido y separando el agua intersticial de las muestras de sedimento para su análisis.
• Especiación de selenio
  Se usará un procedimiento optimizado por el grupo de la UHU, basado en el acoplamiento HPLC-CP-MS, extrayendo las especies con ultrasonidos
• Especiación de estaño
  Se usarán procedimientos desarrollados en la UHU para análisis de muestras medioambientales (sedimentos y biota), usado previamente en dos proyectos europeos (HIC-TBT y OT-SAFE; http://www.ivm.falw.vu.nl/Research_projects/index.cfm).
• Especiación de arsénico
  El análisis de las especies se hará con HPLC-(UV)-HG-ICP-MS [63,64], con una interfase para la generación de hidruros, y un componente opcional con lámpara UV, en dicha interfase, para destruir la parte orgánica de la molécula, cuando las especies de arsénico no generen hidruros (e.g. arsenobetaína).

Microcontamientes Orgánicos

• Plaguicidas y PCBs Para el análisis de plaguicidas y PCBs en matrices ambientales, se usará un procedimiento convencional basado en la extracción soxhlet y purificación con alúmina básica o Florisil, determinándose los contaminantes por cromatografía de gases con detector de captura de electrones (GC-ECD) y/o detector de masas (GC-MS) de carácter más general, pero que presenta una gran selectividad en su modo MS/MS.
• Hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) Se analizarán los 16 PAHs considerados prioritarios por la EPA, la IARC y el Programa Nacional de Toxicología. El análisis de tejidos y sedimentos se hará siguiendo procedimientos utilizados por el grupo de la US y otros autores con ligeras variantes
• Sulfonatos de alquil-bencenos lineales (LAS) En esta etapa inicial del estudio se analizará la presencia de estos contaminantes en suelos/sedimentos utilizando una variante del procedimiento desarrollado por el grupo de la US para fangos de depuradora.
• Contaminantes emergentes Se desarrollarán procedimientos rápidos para la extracción de microcontaminantes orgánicos, plaguicidas, PCBs, PAHs y LAS en suelos/sedimentos y biota. Se estudiarán sistemas de extracción PLE, MAE, UP y MDSE. En la PLE se considerará de forma especial la purificación simultánea en la celda de extracción. Para plaguicidas clorados y PCBs se optimizará un procedimiento desarrollado por el grupo de la UHU para contaminantes volátiles clorados en muestras de alimentos, que utiliza el acoplamiento SPME-GC-ECD-ICP-MS. Para estudiar plaguicidas de baja volatilidad se desarrollarán procedimientos basados en la cromatografía líquida acoplada a detectores de masas híbridos (QqQ y QqTOF).

B. Puesta a punto de metodología para análisis de disruptores endocrinos.

Se aplicarán las metodologías analíticas desarrolladas en la tarea anterior a muestras de sedimentos y bioindicadores que se obtendrán en una campaña de muestreo. Los bioindicadores seleccionados en función de la experiencia adquirida en los estuios previos de RED CONTAMAR y PROTEOBIOMAR, son: los bivalvos Scrobicularia plana y Chamelaea gallina y el poliqueto Nereis diversicolor.

C. Estudio de biomarcadores bioquímicos convencionales.

En extractos citosólicos de glándula digestiva de animales control y problema se analizarán cinco biomarcadores bioquímicos sensibles a distintos tipos de contaminantes:

1. Malondialdehido (MDA), subproducto del ataque oxidativo a lípidos
2. Glucosa-6-P deshidrogenasa (G6PDH), actividad sensible a metales y compuestos prooxidantes
3. Carboxilesterasa (CbE), actividad inhibida por los plaguicidas OPs y CMs detectados en Doñana
4. Carbonización (Prot.C=O) y oxidación de grupos -SH (Prot.S-S) de proteínas, modificaciones de daños oxidativos.

Estudios proteómicos y metalómicos

• Optimización de procedimientos metalómicos en los bindicadores seleccionados Se seguirá un esquema de trabajo bidimensional:
  1. Obtención de perfiles de metalobiomoléculas por SEC-ICP-MS
  2. Purificación de las fracciones separadas por HPLC-ICP-MS.
• Análisis metalómico en primera dimensión (SEC) Se estudiará la fracción citosólica del hepatopancreas de los bioindicadores (20-30 individuos) en los diversos puntos de muestreo. El análisis se llevará a cabo usando la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) acoplada en serie a un detector UV y otro atómico (ICPMS)(16,97).
• Análisis metalómico en segunda dimensión [(RP,RP-IP,SAX,SCX) HPLC] El objetivo de esta segunda dimensión es purificar las fracciones de la primera, y separar diferentes picos cromatográficos que faciliten la identificación de las metalobiomoléculas por MS.
• Identificación por espectrometría de masas de metalobiomoléculas diferencialmente expresadas Las metalobiomoléculas presentes en los picos más interesantes, separados mediante ambas dimensiones cromatográficas, se identificarán además por espectrometría de masas en tandem.

D. Coordinación e integración final de resultados
Los grupos del consorcio estarán en contacto permanente, gracias a los actuales recursos telemáticos, para la coordinación de sus trabajos. Además se organizarán talleres cada 6 meses de forma alternativa en Huelva y Faro para intercambio de experiencias e información, armonización de resultados y transferencia de conocimiento metodológico.

EQUIPOS PARTICIPANTES E HISTORIAL DEL GRUPO DE INVESTIGACIÓN

Equipos participantes

1. JOSE LUIS GÓMEZ ARIZA. Email: Esta dirección electrónica esta protegida contra spam bots. Necesita activar JavaScript para visualizarla
2. MARIA JOAO BEBIANO. Email: Esta dirección electrónica esta protegida contra spam bots. Necesita activar JavaScript para visualizarla
3. JULIAN BLASCO. Email: Esta dirección electrónica esta protegida contra spam bots. Necesita activar JavaScript para visualizarla
4. TAMARA GARCÍA BARRERA. Email: Esta dirección electrónica esta protegida contra spam bots. Necesita activar JavaScript para visualizarla
5. RUT FERNANDEZ TORRES. Email: Esta dirección electrónica esta protegida contra spam bots. Necesita activar JavaScript para visualizarla
6. MACARENA GONZÁLEZ FERNÁNDEZ. Email: Esta dirección electrónica esta protegida contra spam bots. Necesita activar JavaScript para visualizarla
7. FERNANDO MORENO ROLDÁN. Email: fernando.moreno@ dqcm.uhu.es
8. JOSE MANUEL MANSO SAYAGO. Email: jose.manso@ dqcm.uhu.es
9. ROCÍO JARA BIEDMA. Email: Esta dirección electrónica esta protegida contra spam bots. Necesita activar JavaScript para visualizarla
10. MANUEL CONTRERAS ACUÑA. Email: Esta dirección electrónica esta protegida contra spam bots. Necesita activar JavaScript para visualizarla
11. AMANDA GAGO TINOCO. Email: Esta dirección electrónica esta protegida contra spam bots. Necesita activar JavaScript para visualizarla

Historial del grupo de investigación

El grupo de investigación “Análisis Medioambiental y Bioanálisis” perteneciente a la Universidad de Huelva (FQM141) y los grupos de investigación de los Profesores M. Bebiano (Universidad del Algarve - Faro,Portugal) y J. Blasco (Instituto de Ciencias Marinas - Cádiz) que participan en el presente proyecto, han desarrollado una colaboración muy intensa y fructífera en proyectos y estudios anteriores y ha hecho posible la presente propuesta en la que se abordan metodologías realmente innovadoras en el campo de la Química Analítica y de las ómicas, buscando una integración que permita evaluar la respuesta biológica a los efectos de los contaminantes en los sistemas medioambientales.

El grupo FQM141 del Plan Andaluz de Investigación (PAI) lleva más de 25 años desarrollando nuevos procedimientos de análisis, especialmente en el campo de la especiación metálica y metodologías relacionadas con el medio ambiente y la contaminación. La experiencia del grupo en este campo le ha llevado a participar en diversos proyectos como 1FD97-0610, REN2002-04366 y CTM2006-08960, RED CONTAMAR y PROTEOBIOMAR que constituyen claros antecedentes de la presente propuesta.

El grupo FQM-141 es pionero en España en el campo de la especiación química, la metalómica y los estudios medioambientales relacionados con contaminantes diferenciales y emergentes, habiendo participado en 11 proyectos nacionales y 6 europeos, que han generado unas 180 publicaciones en los últimos 15 años. Además el grupo ha sido consultado como experto en temas medioambientales por diversos organismos y entidades públicas mediante convenios o contratos de investigación.