RESUMEN
El desarrollo de herramientas analíticas para diagnosticar situaciones de estrés es clave en la evaluación del deterioro ambiental. El estudio de la presencia de los contaminantes debe ir unido a las respuestas biológicas. Estos estudios son especialmente importantes cuando se consideran contaminantes emergentes, como son los fármacos genéricos, que alcanzan los sistemas acuáticos como consecuencia de no disponerse de depuradoras eficiente para estos contaminantes de nuevo tipo. La puesta a punto de metodologías analíticas adecuadas y eficientes para estos contaminantes debe ir unido al desarrollo de tecnologías ómicas, las cuales pueden jugar un papel esencial para un mayor conocimiento de las respuestas biológicas.
La zona de estudio se centra en marismas y ecosistemas acuáticos de la región transfronteriza de España y Portugal. Se considera en particular la Bahía de Cádiz, la Ría de Huelva, el Paraje Natural Marimas del Odiel, el Estero Domingo Rubio, las Marismas de Isla Cristina, el Río Guadiamar (en la frontera España Portugal) y la Ría Formosa (Portugal). Como bioindicadores se emplearan Scrobicularia plana, Chamalaea gallina y Nerea diversicolor, aunque el estudio no excluye el estudio de algunas especies ictícola o marisqueras de interés comecial o alimentaria.
Se utilizarán metodologías analíticas de última generación como los acoplamientos HPLC-MS, HPLC-ICP-MS, procedimientos proteómicos basados en 2-DE con MALDI-TOF-MS, y tecnicas metalómicas con cromatografía multidimensional, ICP-MS, y espectrometría de masas en tandem
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FINALIDAD DEL PROYECTO
Antecedentes
Entre los numerosos contaminantes que afectan a los ecosistemas acuáticos deben incluirse hoy día los fármacos utilizados para el tratamiento de enfermedades humanas y de los animales. Estas sustancias se consideran como contaminantes emergentes para los que no existe una metodología analítica establecida y no se conoce los niveles en los sistemas acuáticos, terrestres y marinos, ni los metabolitos que generan. Estos compuestos no son totalmente degradados en las depuradoras y tienen una acción toxicológica importante. Las acciones potenciales de estos compuestos son muy diversas, pudiendo activarse distintos mecanismos biológicos de defensa tras una exposición prolongada a los mismos. Estas sustancias pueden afectar a numerosas funciones de los organismos terrestres o marinos, que alteran la viabilidad de las poblaciones, y la posibilidad de uso de estos organismos como alimento. Como consecuencia de ello, su influencia sobre la conservación de los ecosistemas es muy crítica. Una característica importante de los fármacos es que ejercen su acción incluso en concentraciones enormemente bajas. Algunos de estos fármacos pueden afectar a todo tipo de organismos vivos. Entre estos compuestos pueden citarse los analgésicos, antinflamatórios, antibióticos y antidepresivos.
Además, es destacable la producción creciente de especies ictícolas y mariscos para el consumo humano en instalaciones acuícolas, lo que está constituyendo una fuente adicional de contaminación, dado el uso de antibióticos para la preservación de enfermedades. Estas sustancias pueden afectar finalmente a las especies de la pesca de captura. Hay que considerar que aunque los medicamentos no suelen ser compuestos persistentes, su aporte continuo las convierte en contaminantes crónicos de los organismos acuáticos.
Zona de Estudio
El estudio se centrará en diversos ecosistemas del sistema costero del suroeste de España-Portugal (región Algarve-Huelva), donde se localizan varias marismas de gran importancia ecológica: Ría Formosa (Portugal), Río Guadiana (España-Portugal), Marismas de Isla Cristina (Huelva), Paraje Natural Marismas del Odiel (Huelva) y Bahía de Cádiz en las que habitan numerosas aves migratorias y una rica población de invertebrados (Scrobicularia plana, Nereis diversicolor, Chamelaea gallina).
Finalidad
Se pretende desarrollar procedimientos analíticos para el estudio, la caracterización y diagnosis de la presencia de fármacos de carácter genérico en marismas con importancia ecológica de la frontera sur de España-Portugal, en la zona Algarve-Huelva-Cádiz.
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OBJETIVOS DEL PROYECTO
Objetivo General
- Desarrollar procedimientos analíticos para el estudio, la caracterización y diagnosis de la presencia de fármacos de carácter genérico en marismas con importancia ecológica de la frontera sur de España-Portugal, en la zona Algarve-Huelva-Cádiz.
Objetivos Específicos
- Poner a punto metodologías analíticas para el análisis de fármacos en los ecosistemas en estudio.
- Aplicar metodologías analíticas en ecosistemas del suroeste suroeste de España-Portugal (región Algarve-Huelva).
- Estudiar biomarcadores moleculares basados en la caracterización de enzimas antioxidativas, enzimas biotransformadoras, daños oxidativos en biomoléculas, y niveles de metalotioneinas y acetilcolinoesterasa.
- Estudiar los efectos causados por fármacos en diversos bioindicadores de la zona de estudio: (i) S. plana (hepatopancreas y branquias) y Nereis diversicolor.
- Integrar resultados y análisis de datos.
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METODOLOGÍA Y PLAN DE TRABAJO
Se realizaría un muestreo de sedimento y organismos en estaciones seleccionadas en cada una de las zonas de estudio a fin de:
- Analizar los niveles de los compuestos Ibuprofeno, Quinolonas, Diclofenac y Carbamezapine
- Realizar ensayos sobre el efecto de los fármacos citados en los biomarcadores que serán objeto de estudio (Scrobicularia plana y Chamelaea gallina), analizando respuestas a nivel de estrés oxidativo, proteómico, genómico y metalómico.
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A. Puesta a punto de metodología para análisis de fármacos
Los fármacos se extraerán utilizando una mezcla acetonitrilo-agua (3:7) en medio fosfórico y sonda de ultrasonidos. El extracto purificado mediante extracción en fase sólida (C-18), se analiza mediante cromatografía líquida con detector de fluorescencia y ultravioleta, empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo-agua con tampón fosfato y laurilsulfato sódico.
Las penicilinas se determinarán mediante HPLC de fase reversa y detector de UV. La extracción de los compuestos se llevará a cabo en fase acuosa mediante la precipitación de componentes orgánicos con una mezcla de H2SO4 y wolframato sódico. La limpieza de estos extractos se realizará mediante SPE con un adsorbente polimérico (divinilbenceno-co-N-vinilpirrolidona), completándola mediante extracción líquido-líquido con dietileter. Los extractos se derivatizan con anhídrido benzoico y reactivo 1,2,4-Hg(II)-triazol .
Las tetraciclinas se extraerán con una mezcla de ácido metafosfórico/metanol (8:2) al 0.5 % en agua, seguida de purificación con cartuchos C-18. El análisis se lleva a cabo mediante HPLC con fase reversa y detector UV, utilizando como fase móvil MeCN/NaH2PO4 0.05 M.
Los resultados obtenidos en los procedimientos anteriores se confirmarán analizando las muestras simultáneamente mediante HPLC-MS/MS.
Los antiinflamatorios y analgésicos se extraerán con una mezcla metanol-agua (1:1) y sonda de ultrasonidos. Los extractos acuosos se purificarán mediante cartuchos EXtrelut® NT. Los análisis se llevarán a cabo mediante HPLC de fase reversa y elución con gradiente empleando las siguientes fases móviles: A) 20 mM de acetato amónico-1 M ácido acético; B) metanol; y C) agua. La detección se realizará mediante espectrometría de masas.
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B. Evaluación global de la presencia de fármacos en los ecosistemas
Se aplicarán las metodologías analíticas desarrolladas anteriormente a muestras de sedimentos y bioindicadores que se obtendrán en una campaña de muestreo.
Los bioindicadores seleccionados en función de la experiencia adquirida en los estuios previos de RED CONTAMAR y PROTEOBIOMAR, son: los bivalvos Scrobicularia plana y Chamelaea gallina y el poliqueto Nereis diversicolor.
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C. Estudio de biomarcadores convencionales
Se evaluarán los niveles de biomarcadores moleculares basados en la caracterización de enzimas antioxidativas, enzimas biotransformadoras, daños oxidativos en biomoléculas, y niveles de metalotioneinas y acetilcolinoesterasa en los bioindicdores y zonas seleccionados.
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D. Estudios ómicos (proteómicos y metalómicos).
Se evaluarán los efectos de los fármacos empleando nuevas técnicas de información masiva sobre la evolución de las biomoléculas (procesos de sobre expresión o inhibición) en los bioindicadores de los ecosistemas en estudio.
Los estudio de efecto de los fármacos se realizará utilizando S. plana (hepatopancreas y branquias) y Nereis diversicolor. Se utilizarán técnicas proteómicas (2-D GE con análisis de las manchas críticas con espectrometría de masas) para comprobar los cambios de expresión proteica causados por la presencia de fármacos; y técnicas metalómicas (cromatografía multidimensional con detección ICP-MS) para identificar la acción de los fármacos sobre la presencia de metalobiomoléculas
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E. Coordinación e integración de resultados.
Los grupos del consorcio estarán en contacto permanente, gracias a los actuales recursos telemáticos, para la coordinación de sus trabajos. Además se organizarán talleres cada 6 meses de forma alternativa en Huelva y Faro para intercambio de experiencias e información, armonización de resultados y transferencia de conocimiento metodológico.
Con la información que se genere se podrá establecer recomendaciones sobre acciones correctoras para evitar el efecto de los contaminantes emergentes considerados en el área costera del suroeste de España-Portugal.
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EQUIPOS PARTICIPANTES E HISTORIAL DEL GRUPO DE INVESTIGACIÓN
Equipos participantes
- JOSE LUIS GÓMEZ ARIZA. Email:
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- MARIA JOAO BEBIANO. Email:
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- JULIAN BLASCO. Email:
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- TAMARA GARCÍA BARRERA. Email:
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- RUT FERNANDEZ TORRES. Email:
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- MACARENA GONZÁLEZ FERNÁNDEZ. Email:
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- FERNANDO MORENO ROLDÁN. Email: fernando.moreno@ dqcm.uhu.es
- JOSE MANUEL MANSO SAYAGO. Email: jose.manso@ dqcm.uhu.es
- ROCÍO JARA BIEDMA. Email:
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- MANUEL CONTRERAS ACUÑA. Email:
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- AMANDA GAGO TINOCO. Email:
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Historial del grupo de investigación
El grupo de investigación “Análisis Medioambiental y Bioanálisis” perteneciente a la Universidad de Huelva (FQM141) y los grupos de investigación de los Profesores M. Bebiano (Universidad del Algarve - Faro,Portugal) y J. Blasco (Instituto de Ciencias Marinas - Cádiz) que participan en el presente proyecto, han desarrollado una colaboración muy intensa y fructífera en proyectos y estudios anteriores y ha hecho posible la presente propuesta en la que se abordan metodologías realmente innovadoras en el campo de la Química Analítica y de las ómicas, buscando una integración que permita evaluar la respuesta biológica a los efectos de los contaminantes en los sistemas medioambientales.
El grupo FQM141 del Plan Andaluz de Investigación (PAI) lleva más de 25 años desarrollando nuevos procedimientos de análisis, especialmente en el campo de la especiación metálica y metodologías relacionadas con el medio ambiente y la contaminación. La experiencia del grupo en este campo le ha llevado a participar en diversos proyectos como 1FD97-0610, REN2002-04366 y CTM2006-08960, RED CONTAMAR y PROTEOBIOMAR que constituyen claros antecedentes de la presente propuesta.
El grupo FQM-141 es pionero en España en el campo de la especiación química, la metalómica y los estudios medioambientales relacionados con contaminantes diferenciales y emergentes, habiendo participado en 11 proyectos nacionales y 6 europeos, que han generado unas 180 publicaciones en los últimos 15 años. Además el grupo ha sido consultado como experto en temas medioambientales por diversos organismos y entidades públicas mediante convenios o contratos de investigación.
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